Winpocetyna łagodzi hiperaktywność wywołaną ekspozycją na ołów u myszy

Metodyka badania naukowego

Badanie stanowi eksperyment laboratoryjny na modelu zwierzęcym, w którym oceniano wpływ wczesnej ekspozycji na ołów na aktywność lokomotoryczną u myszy oraz możliwości terapeutyczne stosowania winpocetyny. Eksperyment został zaplanowany jako badanie interwencyjne z grupą kontrolną, w którym zwierzęta były najpierw eksponowane na ołów w okresie rozwojowym, a następnie otrzymywały leczenie winpocetyną lub placebo w celu oceny efektów terapeutycznych. Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Universidade do Estado do Rio de Janeiro (protokół #: CEUA/040/2010) i przeprowadzone zgodnie z brazylijskim prawem 11.794/2008.

Kto był badany?

Badanie przeprowadzono na myszach szczepu Swiss. Grupę eksponowaną na ołów (LEAD) stanowiły myszy, których matki (n=9) były eksponowane na octan ołowiu trójwodny (90 ppm ołowiu) poprzez wodę pitną od 60 dni przed zapłodnieniem do 10 dnia po urodzeniu (PN10). Grupę kontrolną (CONT) stanowiły myszy, których matki (n=10) piły przefiltrowaną wodę. W 30. dniu po urodzeniu (PN30) zwierzęta z każdego miotu zostały losowo przydzielone do grupy otrzymującej pojedynczą dawkę dootrzewnową winpocetyny (VINP: 20 mg/kg) lub równoważną objętość nośnika. Utworzono cztery grupy eksperymentalne: CONT+VEH (23 samce i 19 samic), CONT+VINP (22 samce i 20 samic), LEAD+VEH (24 samce i 25 samic) oraz LEAD+VINP (23 samce i 29 samic).

Opis badania

Badanie miało na celu ocenę, czy winpocetyna może przywrócić normalną aktywność lokomotoryczną u myszy eksponowanych na ołów w okresie rozwojowym. Wybrane stężenie ołowiu (90 ppm) wywoływało poziomy ołowiu we krwi (BLL) w zakresie 4,4-16,6 µg/dL, co jest porównywalne z poziomami obserwowanymi w badaniach ekspozycji na ołów u dzieci i zgodne z wartością referencyjną 3,5 μg/dL proponowaną przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC).

Aktywność lokomotoryczną oceniano w teście otwartego pola, gdzie mierzono liczbę przekroczeń prostokątów w arenie testowej w czasie 10-minutowej sesji. Analizowano aktywność na obwodzie areny (Pe), w centrum (C), stosunek C/Pe oraz całkowitą aktywność (Pe+C). Dodatkowo, aby uwzględnić różnicę w liczbie prostokątów między centrum a obwodem, liczbę przekroczonych prostokątów w centrum podzielono przez 4 (C/4), a na obwodzie przez 12 (Pe/12).

Poziomy ołowiu we krwi (BLL) mierzono u losowo wybranych zwierząt w PN10 (koniec okresu ekspozycji) oraz po zakończeniu testów behawioralnych. Pomiary przeprowadzono przy użyciu spektrometru absorpcji atomowej Perkin Elmer 5100 z granitowym piecem, działającym przy długości fali 283,3 nm, temperaturze atomizacji 1900°C i limicie detekcji 0,6 µg/dL.

Badanie opiera się na wcześniejszych ustaleniach, że zaburzenia w szlakach sygnalizacyjnych cAMP i cGMP odgrywają istotną rolę w hiperaktywności lokomotorycznej. Ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym zmniejsza podjednostki NR1 i NR2A receptorów NMDA w hipokampie młodocianych szczurów, obniża poziom dopaminy w prążkowiu i noradrenaliny w móżdżku oraz zakłóca sygnalizację, wpływając na wiązanie białka CREB, fosforylację i aktywność transkrypcyjną.

Wyniki

Poziomy ołowiu we krwi: W PN10 średni BLL dla grupy LEAD był znacząco wyższy niż w grupie CONT. Jak oczekiwano, średni BLL mierzony w PN30 był znacząco niższy niż wartość w PN10 i nie różnił się od poziomu obserwowanego u rówieśników z grupy kontrolnej. Nie stwierdzono różnic w BLL między samcami a samicami w PN30.

Wielkość miotu i przyrost masy ciała: W PN2 średnia wielkość miotu grup CONT (10,5 ± 0,8 młodych) i LEAD (12,9 ± 0,8 młodych) nie różniła się. Średnia masa ciała miotów z obu grup eksperymentalnych znacząco wzrosła od PN2 do PN21. Chociaż mioty CONT były cięższe niż mioty LEAD w PN2, nie zaobserwowano różnic w przyroście masy ciała między grupami eksperymentalnymi w PN10 i PN21. W PN30 średnia masa ciała samców (23,7 ± 1,0 g) była znacząco wyższa niż samic (20,1 ± 1,0 g), ale nie zaobserwowano różnic w masie ciała między grupami CONT i LEAD.

Aktywność lokomotoryczna: Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, aktywność na obwodzie otwartego pola była znacząco większa niż w centrum, niezależnie od płci i przypisania do grupy. Różnica ta pozostawała istotna nawet po skorygowaniu o liczbę prostokątów na obwodzie i w centrum areny.

Ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym indukowała hiperaktywność lokomotoryczną w sposób zależny od płci. Całkowita aktywność ambulatoryjna samic eksponowanych na ołów była o około 31% wyższa (+50,8 prostokątów) niż u samic kontrolnych. W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym nie prowadziła do zwiększenia aktywności lokomotorycznej u samców.

Grupa	Całkowita aktywność lokomotoryczna (liczba prostokątów)	Zmiana względem kontroli
Samice CONT+VEH	~165	–
Samice LEAD+VEH	~216	+31%
Samice LEAD+VINP	~177	+7% (względem kontroli), -23% (względem LEAD+VEH)
Samce	Brak istotnych różnic między grupami	–

Wpływ winpocetyny: Samice eksponowane na ołów, które otrzymały winpocetynę, wykazywały znacząco mniejszą aktywność ambulatoryjną (-23%, -38,5 prostokątów) niż te bez leczenia. Co więcej, poziomy aktywności lokomotorycznej samic eksponowanych na ołów leczonych winpocetyną były podobne do poziomów obu grup kontrolnych, CONT+VEH i CONT+VINP. Natomiast leczenie winpocetyną nie miało wpływu na aktywność lokomotoryczną samców eksponowanych na ołów.

Wskaźniki lęku: Zarówno dla aktywności w centrum, jak i dla danych dotyczących stosunku C/Pe, zaobserwowano wzrost wartości w 10 przedziałach czasowych. Jednak nie stwierdzono różnic między grupami dla tych dwóch zmiennych, co sugeruje, że ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym nie wpłynęła na poziom lęku, a leczenie winpocetyną nie wpłynęło w sposób zróżnicowany na poziomy lęku.

Wnioski

Badanie wykazało, że ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym zwiększa aktywność lokomotoryczną u samic myszy, a leczenie winpocetyną znacząco łagodzi tę wywołaną przez ołów hiperaktywność. Co istotne, leczenie winpocetyną było podawane długo po okresie ekspozycji na ołów, w stadium rozwojowym porównywalnym do okresu niemowlęcego/dojrzewania u ludzi.

Wyniki te sugerują, że systemy sygnalizacji nukleotydów cyklicznych, szczególnie cAMP i cGMP, odgrywają rolę w hiperaktywności wywołanej przez ołów. Zaburzenia w szlakach sygnalizacyjnych cAMP i cGMP mogą leżeć u podstaw hiperaktywności wywołanej ołowiem. Winpocetyna, jako inhibitor fosfodiesterazy typu 1 (PDE1), zapobiega rozkładowi cyklicznych nukleotydów cAMP i cGMP do ich 5′-monofosforanów, utrzymując aktywację kinaz białkowych i czynników transkrypcyjnych CREB i SRF.

Oprócz hamowania PDE1, winpocetyna może mieć inne działania, które odgrywają rolę w łagodzeniu hiperaktywności u myszy eksponowanych na ołów. Na przykład, u szczurów prenatalnie eksponowanych na etanol, winpocetyna wykazuje znaczące działanie przeciwzapalne, zmniejszając poziomy cytokin prozapalnych i zwiększając poziomy cytokin przeciwzapalnych, a także zmniejszając stres oksydacyjny. Warto zauważyć, że ekspozycja na ołów również promuje zarówno stan zapalny, jak i stres oksydacyjny w tkance mózgowej.

Badanie wskazuje na potencjalne zastosowanie terapeutyczne winpocetyny u osób, które były narażone na działanie ołowiu w okresie rozwojowym. Ponadto, wyniki podkreślają różnice płciowe w podatności na neurotoksyczne działanie ołowiu oraz w odpowiedzi na leczenie, co ma istotne implikacje dla zrozumienia i leczenia zaburzeń neurobehawioralnych związanych z ekspozycją na ołów.

Ograniczeniem badania był brak długoterminowych ocen behawioralnych. Mimo że mechanizm molekularny związany z długotrwałymi zmianami w wydajności synaptycznej jest powiązany z aktywacją zarówno CREB, jak i SRF, efekty winpocetyny jako środka regeneracyjnego zostały potwierdzone tylko dla krótkich okresów po leczeniu. Przyszłe badania powinny również uwzględnić podawanie wielokrotnych dawek, ponieważ efekty winpocetyny mogą nie trwać dłużej niż kilka godzin po pojedynczym wstrzyknięciu.

Ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym wiąże się nie tylko z objawami behawioralnymi ADHD, ale także ze schizofrenią, niższym ilorazem inteligencji, upośledzeniem uczenia się i pamięci oraz zachowaniem autystycznym. To szerokie spektrum zaburzeń neurobehawioralnych może być związane z wielorakim charakterem uszkodzeń wywołanych przez ołów i, w konsekwencji, ogranicza rozwój podejść terapeutycznych do problemów neurobehawioralnych obserwowanych u osób wcześnie narażonych na ołów. W tym kontekście zastosowanie winpocetyny może być interesujące, ponieważ w modelach zwierzęcych wykazano jej zdolność do łagodzenia hiperaktywności lokomotorycznej, nieuwagi, lęku i deficytów pamięci uczenia się.

Podsumowanie

Eksperyment laboratoryjny przeprowadzony na myszach wykazał, że ekspozycja na ołów w okresie rozwojowym powoduje hiperaktywność lokomotoryczną u samic (wzrost o 31%), ale nie u samców. Pojedyncza dawka winpocetyny (20 mg/kg) znacząco zredukowała tę hiperaktywność o 23%, przywracając poziomy aktywności zbliżone do grupy kontrolnej. Poziomy ołowiu we krwi (4,4-16,6 µg/dL) były porównywalne z obserwowanymi u dzieci. Badanie sugeruje, że winpocetyna, poprzez wpływ na szlaki sygnalizacyjne cAMP i cGMP, może być potencjalnym środkiem terapeutycznym dla osób narażonych na działanie ołowiu w okresie rozwojowym. Zaobserwowano istotne różnice w odpowiedzi na leczenie między płciami, co ma znaczące implikacje dla przyszłych terapii.

Bibliografia

Araujo Ulisses C., Nunes Fernanda, Gonçalves Bruno S., Gomes Regina A. A., Moreira Maria de Fátima R., Nunes-Freitas Andre, Krahe Thomas E., de Abreu-Villaça Yael, Manhães Alex C. and Filgueiras Cláudio C.. Vinpocetine, a Phosphodiesterase Type 1 Inhibitor, Mitigates Locomotor Hyperactivity in Female Mice Exposed to Lead During Development. Brain Sciences 2025, 15(2), 3-12. DOI: https://doi.org/10.3390/brainsci15020150.