System NGC z winpocetynową nanoformulacją w regeneracji nerwów

Czy możliwa jest skuteczna alternatywa dla przeszczepów nerwów?

Urazy nerwów obwodowych (PNI) stanowią jedno z najczęstszych i najtrudniejszych do leczenia wyzwań klinicznych, szczególnie w kontekście złożonych złamań kości. Te wieloaspektowe uszkodzenia, będące efektem ciężkich urazów – wypadków wysokoenergetycznych, ran bojowych czy katastrofalnych upadków – wywołują kaskadę powiązanych zmian patofizjologicznych: zaburzoną regenerację nerwową, zanik mięśni i nieodwracalną utratę funkcji czuciowych lub ruchowych.

Układ nerwowy obwodowy ma duży potencjał regeneracyjny, jednak przywrócenie funkcji jest często niepełne, zwłaszcza gdy występuje ubytek nerwu, a środowisko lokalne jest zmienione przez zapalenie i bliznowacenie. Autologiczny przeszczep nerwowy pozostaje złotym standardem w pomostowaniu dużych ubytków nerwowych. Jednak ze względu na różne ograniczenia – takie jak powikłania w miejscu pobrania tkanki i ograniczona podaż – istnieje znaczące zapotrzebowanie na alternatywne i skuteczne opcje terapeutyczne wspierające regenerację nerwów obwodowych po urazie.

Inżynieria tkankowa i medycyna regeneracyjna oferują obiecujące kierunki rozwoju bioinżynieryjnych przewodników nerwowych (NGC), które mogą odtwarzać naturalne środowisko nerwu, jednocześnie wspierając wzrost aksonów i naprawę funkcjonalną. Ostatnie postępy w dziedzinie wytwarzania rusztowań, dostarczania bioaktywnych cząsteczek oraz biologii komórek macierzystych umożliwiły rozwój wysoce złożonych konstrukcji biomimetycznych.

Na czym polega innowacyjny system NGC?

Naukowcy z Taiyuan Central Hospital i Shanxi Medical University zaprojektowali nowy nanokompozytowy przewodnik nerwowy (NGC), który składa się z elektroprzędzionych rusztowań PCL/kollagen oraz hydrożelu na bazie kolagenu zawierającego winpocetynę zamkniętą w chitozanowych nanocząstkach (VINCNPs) wraz z komórkami macierzystymi pochodzącymi z krwi miesiączkowej (MenSCs). To połączone podejście potencjalnie przezwycięża wiele istniejących wyzwań w naprawie nerwów.

Elektroprzędziony rusztowanie PCL/kollagen tworzy tubularną ścianę NGC, zapewniając wsparcie strukturalne i przewodnictwo dla regenerujących się aksonów. Hydrożel umieszczony wewnątrz przewodnika, złożony z kolagenu, odtwarza miękkie i nawodnione środowisko natywnej tkanki nerwowej oraz działa jako depot do dostarczania bioaktywnych czynników i komórek.

Jednym z najbardziej innowacyjnych komponentów tego systemu jest kontrolowane dostarczanie winpocetyny – syntetycznego pochodnego alkaloidu winkaminy, znanego ze swoich neuroprotekcyjnych, przeciwzapalnych i antyoksydacyjnych właściwości. Winpocetyna hamuje fosfodiesterazę typu 1 (PDE1), zwiększając wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i cGMP, co odgrywa rolę w promowaniu wzrostu neurytów i redukcji zapalenia. Ten lek wykazuje obiecujące działanie neuroprotekcyjne i analgetyczne w modelach urazów nerwów obwodowych, głównie poprzez mechanizmy redukujące stres oksydacyjny, wzmacniające biogenezę mitochondrialną oraz hamujące neurozapalenie i nadpobudliwość neuronalną.

Jednak słaba rozpuszczalność w wodzie i krótki okres półtrwania ograniczają potencjał terapeutyczny winpocetyny. Formulacja winpocetyny w chitozanowych nanocząstkach oferuje zalety kontrolowanego uwalniania, lepszej rozpuszczalności i stabilności. Chitozan to biokompatybilny i biodegradowalny polimer o wrodzonej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i wspomagającej gojenie ran, co dodatkowo wzmacnia środowisko regeneracyjne.

Dodanie MenSCs zapewnia aktywny komponent komórkowy w konstrukcji hydrożelowej. MenSCs to nieinwazyjnie pozyskiwane mezenchymalne komórki macierzyste z krwi miesiączkowej, które wykazują potencjał regeneracyjny ze względu na wysoką zdolność proliferacji, immunomodulację oraz wydzielanie czynników neurotroficznych i angiogennych. W naprawie nerwów obwodowych, oprócz potencjału MenSCs do różnicowania się w komórki podobne do komórek Schwanna, mogą one również promować odrastanie aksonów i mielinizację poprzez mechanizmy parakrynne.

Jak przeprowadzono badanie przedkliniczne?

Naukowcy wytworzyli elektroprzędziony rusztowanie PCL/kollagen metodą elektroprzędzania z kwasu octowego jako rozpuszczalnika. PCL i kollagen typu I połączono w stosunku wagowym 80:20, aby uzyskać 12% w/v roztwór mieszanego polimeru. Elektroprzędzanie prowadzono przy napięciu 20 kV, szybkości przepływu roztworu 0,75 mL/h i odległości 15 cm między igłą a kolektorem. Po 10 godzinach uzyskano jednolitą matę nanofibrową o grubości 200 μm, którą następnie zwinięto 5 razy, tworząc tubki nerwowe o grubości około 1000 μm.

Winpocetynę zamknięto w chitozanowych nanocząstkach (VINCNPs) metodą żelowania jonowego z użyciem tripolifosforanu sodu (TPP) jako środka sieciującego. Chitozan rozpuszczono w 1% kwasie octowym do stężenia 0,2% w/v, następnie dodano winpocetynę (1% w/w). Roztwór TPP (0,1% w/v) dodawano kroplami do roztworu chitozan-lek przy mieszaniu magnetycznym (800 rpm). Jonowe sieciowanie między dodatnio naładowaną grupą aminową chitosanu a ujemnie naładowaną grupą fosforanową TPP prowadziło do spontanicznego tworzenia nanocząstek.

Hydrożel kolagenowy (5 mg/mL) połączono z 2% w/w VINCNPs na lodzie. MenSCs (pochodzące od człowieka, pasaż 3) zawieszono w medium DMEM-F12 z 10% FBS i 1% antybiotykami przy gęstości 750 000 komórek/mL i połączono z równą objętością roztworu kollagen/VINCNPs na lodzie. Powstały roztwór wstrzyknięto do światła NGC PCL/kollagen po implantacji.

Badanie in vivo przeprowadzono na 30 dorosłych samcach szczurów Wistar (250–300 g), losowo podzielonych na sześć grup (n=5 na grupę):

• Grupa 1 (HYDVINMEN): NGC PCL/kollagen wypełniony hydrożelem HYDVINMEN
• Grupa 2 (HYDMEN): NGC PCL/kollagen wypełniony hydrożelem HYDMEN (bez VINCNPs)
• Grupa 3 (COLHYD): NGC PCL/kollagen wypełniony hydrożelem COLHYD (tylko kollagen)
• Grupa 4 (PCL/Kollagen Blank): Pusty NGC PCL/kollagen bez hydrożelu
• Grupa 5 (Autograft): Autologiczny przeszczep nerwowy
• Grupa 6 (kontrola negatywna): Nerw kulszowy uszkodzony, bez leczenia

Szczury znieczulono wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Lewa tylna kończyna została ogolona i zdezynfekowana, a następnie wykonano nacięcie skóry, aby odsłonić nerw kulszowy. W grupach 1–5 wycięto 10-mm segment nerwu kulszowego, tworząc ubytek o krytycznym rozmiarze. W grupach 1–3 ubytek pomostowano NGC PCL/kollagen wypełnionym odpowiednią formulacją hydrożelu. W grupie 4 wszczepiono pusty przewodnik bez wypełnienia. W grupie 5 wycięty segment nerwu odwrócono i wszył z powrotem jako autograft. Grupa 6 służyła jako operacja pozorowana i przeszła tylko odsłonięcie nerwu bez przecięcia.

Zwierzęta monitorowano codziennie i leczono enrofloksacyną (10 mg/kg, dootrzewnowo) przez 3 dni po operacji. Po zabiegu podawano analgezję pooperacyjną w postaci podskórnej buprenorfiny (0,05 mg/kg) natychmiast po operacji i powtarzano co 12 godzin przez 48 godzin. Opieka pooperacyjna obejmowała również codzienne monitorowanie oznak bólu lub dyskomfortu.

Jakie właściwości wykazał opracowany system?

Badania mikrostruktury metodą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazały, że rusztowanie PCL/kollagen składało się z losowo ułożonych, gładkich nanowłókien o jednolitym rozkładzie średnicy, co sugeruje udane wytworzenie mieszanego rusztowania elektroprzędzonego. VINCNPs miały kulisty kształt z umiarkowanie gładkimi powierzchniami i skromnym rozkładem wielkości.

Przekrój trzech hydrożeli na bazie kolagenu wykazał widoczne i wyraźne różnice w strukturze wewnętrznej. Hydrożel HYDVINMEN, który składał się z VINCNPs z MenSCs, prezentował gęstą, wzajemnie połączoną morfologię porowatą, która jest zwarta. Hydrożel HYDMEN, bez nanocząstek, wydawał się luźniejszy z większymi porami i bardziej włóknistą strukturą. Hydrożel COLHYD, który zawierał tylko kollagen, miał mniej zdefiniowaną strukturę, z morfologią przypominającą arkusz i ledwo zauważalnymi porami.

Test MTT wykazał, że zarówno rusztowanie PCL/kollagen, jak i płytka hodowlana wspierały progresywną proliferację komórek w czasie. Wartości gęstości optycznej przy 570 nm wzrosły od dnia 1 do dnia 5 w obu grupach, wskazując na czasowo zależny wzrost komórek. Chociaż nie było statystycznie istotnych różnic między grupami w żadnym punkcie czasowym, rusztowanie PCL/kollagen wykazało porównywalną lub nieco wyższą aktywność metaboliczną niż kontrola, sugerując dobrą cytokompatybilność struktury elektroprzędzonej.

Analiza wytrzymałości mechanicznej wykazała, że rusztowania PCL/kollagen miały około 3,387 ± 0,434 MPa ostatecznej wytrzymałości na rozciąganie (UTS). Wartość ta mieści się w zakresie zgłaszanej wytrzymałości natywnych nerwów obwodowych, które wynoszą 1–3 MPa w zależności od typu nerwu, gatunku i warunków testowych.

Efektywność enkapsulacji (EE%) winpocetyny w VINCNPs wynosiła 44,78 ± 6,46%. Kumulacyjny profil uwalniania winpocetyny z VINCNPs wykazał dwufazowy wzór uwalniania w okresie 7 dni. W ciągu pierwszych 24 godzin kumulacyjne uwalnianie osiągnęło 23,32 ± 6,12%. Ta szybka faza uwalniania prawdopodobnie odpowiada dyfuzji leku związanego z powierzchnią. Następnie zaobserwowano trwałe i stopniowe zwiększenie uwalniania, osiągając 32,91 ± 4,39% przy 48 h i 48,20 ± 5,10% przy 72 h. Uwalnianie nadal rosło stabilnie, z wartościami 54,31 ± 8,28% przy 120 h i 63,37 ± 5,05% przy 168 h.

Test pęcznienia wykazał, że wszystkie próbki hydrożelu miały początkowe szybkie pęcznienie w ciągu pierwszych godzin inkubacji i osiągnęły maksymalny limit pęcznienia w pierwszych 4–8 godzinach. Później pęcznienie stopniowo malało we wszystkich grupach z czasem i było bardziej widoczne po 24 godzinach. Brak istotnych różnic między grupami sugeruje, że włączenie VINCNPs i/lub MenSCs nie wpłynęło negatywnie na zachowanie pęcznienia hydrożelu na bazie kolagenu.

Profil degradacji rusztowania PCL/kollagen elektroprzędzonego w ciągu 60 dni inkubacji w pełnym medium hodowlanym wykazał, że tempo degradacji (procent utraty masy) nadal rosło z czasem. W początkowych 20 dniach występowało powolne tempo degradacji z nagłym wzrostem od dnia 30. Maksymalną degradację zanotowano między dniami 30 a 60. Pod koniec 60. dnia tempo degradacji rusztowań wynosiło około 20,64 ± 1,83%.

Test hemokompatybilności wykazał, że wszystkie próbki hydrożelu oraz rusztowania elektroprzędzonego wykazywały minimalną hemolizę, znacznie poniżej krytycznego 5% progu hemolizy dla biomateriałów kontaktujących się z krwią. Te dane ujawniają, że oceniane formulacje (HYDVINMEN, HYDMEN, COLHYD i rusztowanie PCL/kollagen) są niehemolityczne i można je stosować in vivo w aplikacjach kontaktujących się z krwią.

Jak system NGC sprawdził się w modelu zwierzęcym?

Zwierzęta zostały poświęcone 8 tygodni po zabiegu zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucjonalnymi. Regenerowany segment nerwu, w tym 5 mm nerwu dystalnego i proksymalnego do miejsca naprawy, został starannie wycięty przy użyciu narzędzi mikrochirurgicznych.

Barwienie H&E reprezentatywnych przekrojów poprzecznych nerwu kulszowego wykazało, że w grupie autograftu fascykuły nerwowe były dobrze zdefiniowane z gęstym upakowaniem aksonów i minimalnym zakłóceniem architektury tkanki łącznej. Wzór fascykularny był wyraźnie zachowany, a barwienie LFB było silne i jednolite, co odzwierciedla rozległą remielinizację. W grupie HYDVINMEN fascykuły nerwowe pojawiały się jako wysoce zorganizowane wiązki aksonów ze zmniejszonymi przestrzeniami endoneuralnymi. Występowała minimalna infiltracja włóknista, a perineurium było dobrze wyznaczone. Barwienie LFB wykazało znaczną reformację osłonek mielinowych z konsekwentną niebieską intensywnością w większości fascykuli.

W grupie HYDMEN fascykuły były umiarkowanie zorganizowane ze zwiększonymi przestrzeniami międzyfascykularnymi i mniej gęstą zawartością aksonalną w porównaniu z grupami autograftu i HYDVINMEN. Barwienie LFB było widoczne, ale o niższej intensywności i jednolitości, sugerując częściową remielinizację. W grupie COLHYD ogólna struktura nerwu wydawała się luźno zorganizowana z pofragmentowanymi fascykulami i zwiększonym odkładaniem macierzy włóknistej. Barwienie H&E wykazało rozproszone profile aksonalne z łagodną infiltracją komórek zapalnych, a barwienie LFB wskazywało na słabą i łatową mielinizację.

W grupie PCL/Collagen Blank morfologia nerwu była zakłócona ze słabo zorganizowanymi fascykulami i rozproszonymi fragmentami aksonalnymi. Tkanka była infiltrowana przez włóknistą tkankę łączną, a barwienie LFB było minimalne, odzwierciedlając niewystarczającą remielinizację. W grupie kontrolnej negatywnej, w której ubytek nerwu pozostawiono nienaprawiony, zaobserwowano ciężką degenerację. Struktury fascykularne wydawały się zapadnięte z rozległą fibrozą i dezorganizacją komórkową. Barwienie LFB było słabe i nieregularne, potwierdzając brak regeneracji włókien zmielinizowanych.

Barwienie H&E i Masson’s Trichrome obrazów mięśnia brzuchatego łydki wykazało, że w grupie autograftu włókna mięśniowe były dobrze zorganizowane, z konsekwentną morfologią wielokątną i minimalną przestrzenią śródmiąższową, nie wykazując znaczących oznak zaniku. W grupie HYDVINMEN włókna były na ogół dobrze zachowane i wykazywały łagodne różnice w wielkości. Architektura była względnie zachowana w tej grupie, a barwienie Masson’s Trichrome ujawniło niskie odkładanie kolagenu, wskazując na minimalne przebudowanie włókniste.

W grupie HYDMEN mięsień wykazywał oznaki umiarkowanej degeneracji. Barwione sekcje wykazywały wyższy stopień zmienności wielkości włókien i wczesny kątowy zanik z bardziej widocznymi przestrzeniami między włóknami. W grupie COLHYD włókna mięśniowe były bardziej nieregularne i mniejsze z oznakami umiarkowanego zaniku. W grupie PCL/Collagen Blank włókna mięśniowe wykazywały oznaki zaniku z nieregularnymi, kątowymi kształtami i zwiększoną przestrzenią endomysjalną. W grupie kontrolnej negatywnej, która nie otrzymała żadnego leczenia, zaobserwowano ciężką degenerację mięśnia, charakteryzującą się pofragmentowanymi i zdezorganizowanymi włóknami.

Funkcja motoryczna została oceniona za pomocą analizy śladu chodu i obliczenia wskaźnika funkcji kulszowej (SFI). W tygodniu 4 i 8 grupy autograftu i HYDVINMEN miały najlepszą regenerację funkcjonalną w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami, ponieważ miały najwyższe (najmniej ujemne) wartości SFI. Grupy HYDMEN, COLHYD i PCL/Collagen Blank miały znacznie gorsze wyniki funkcjonalne z niższymi wartościami SFI. Grupa kontrolna negatywna miała najgorszą funkcję, ponieważ miała najniższe wartości SFI w obu punktach czasowych.

Test płyty gorącej do oceny powrotu funkcji czuciowych wykazał, że grupa autograftu miała najniższy czas opóźnienia, co oznacza, że miała najbardziej kompletny powrót czucia ze wszystkich grup. Grupy HYDMEN, COLHYD i PCL/Collagen Blank wszystkie miały znacznie wyższe czasy opóźnienia niż grupa HYDVINMEN (p < 0,05). Grupa autograftu miała znacznie niższy czas opóźnienia niż grupa HYDVINMEN. Grupa kontrolna negatywna miała najwyższe opóźnienie, ponieważ nie było regeneracji nerwu bez leczenia.

Grupa autograftu miała najniższy stopień zaniku, co potwierdziło zdolność autograftu do zapobiegania zanikowi mięśniowemu poprzez pełną regenerację nerwu. Grupa HYDVINMEN miała pośredni poziom utraty wagi, znacznie mniejszy niż wszystkie inne grupy leczenia (z wyjątkiem autograftu), wskazując na udaną reinnerwację mięśni poprzez połączone dostarczanie VINCNPs i MenSCs. Grupy HYDMEN, COLHYD i PCL/Collagen Blank miały znacznie wyższe stopnie utraty wagi mięśni niż zarówno HYDVINMEN, jak i autograft, podczas gdy kontrola negatywna miała prawie całkowitą utratę masy mięśniowej, wskazując, że mięsień nie był reinnerwowany w przypadku braku jakiegokolwiek leczenia.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za efektem terapeutycznym?

Analiza ELISA wykazała, że zawartość TGF-β była znacznie wyższa w grupie HYDVINMEN i grupie autograftu niż we wszystkich innych grupach, pokazując znaczną poprawę w czynnikach przeciwzapalnych i regeneracyjnych. Zawartość b-FGF, VEGF, NGF i BDNF również miała podobny trend; grupa HYDVINMEN i grupa autograftu były znacznie wyższe niż wszystkie inne grupy we wszystkich markerach, wskazując na silny efekt neurotroficzny i angiogenny.

W przeciwieństwie do tego, zawartość TNF-α i IL-6 była znacznie wyższa w grupie kontrolnej negatywnej i grupie PCL/Collagen Blank niż we wszystkich innych grupach i była znacznie niższa w grupie HYDVINMEN, potwierdzając silny efekt przeciwzapalny.

“Nasze wyniki sugerują, że połączone dostarczanie MenSCs i winpocetyny poprzez przewodnik nerwowy może skutkować synergistycznym efektem w naprawie PNI” – piszą autorzy badania. Hipoteza ta opiera się zarówno na własnych obserwacjach, jak i doniesieniach innych badaczy.

Funkcja neuroprotekcyjna winpocetyny została dobrze udokumentowana w poprzednich badaniach. Yelkenchi i wsp. wykazali, że winpocetyna, będąca środkiem neuroprotekcyjnym o działaniu przeciwzapalnym i antyoksydacyjnym, łagodziła uszkodzenie mózgu w myśim modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) indukowanego zimnem. Leczenie skutkowało wyraźną redukcją objętości zawału, obrzęku mózgu, uszkodzenia bariery krew-mózg i fragmentacji DNA. Wykazano również przywrócenie przeżycia neuronów, funkcji motorycznych i neurogenezy.

Winpocetyna poprawiała dyskinezję u szczurów z chorobą Parkinsona poprzez redukcję stresu oksydacyjnego, zwiększenie aktywności antyoksydacyjnej i aktywację szlaku sygnałowego Wnt/β-katenina, prowadząc do lepszej funkcji motorycznej i ochrony neuronów. Lek ten również znacznie zmniejszył toksyczność hipokampu indukowaną metotreksatem u szczurów poprzez aktywację sygnalizacji antyoksydacyjnej Keap-1/Nrf2, hamowanie zapalenia NF-κB/AP-1 i modulację markerów apoptotycznych, chroniąc tym samym neurony i poprawiając integralność hipokampu.

Efekt neuroprotekcyjny podawania MenSCs został wykazany w poprzednich doniesieniach. Wu i wsp. zgłosili, że MenSCs znacznie poprawiły regenerację funkcjonalną w modelu hemisection rdzenia kręgowego szczura poprzez zwiększenie ekspresji BDNF, promowanie regeneracji aksonalnej, zmniejszenie cytokin zapalnych (TNF-α, IL-1β) i ograniczenie tworzenia się jam. Brolongan i wsp. dostarczyli dowodów, że MenSCs wykazywały markery komórek macierzystych i neuronalne oraz mogły wywierać neuroprotekcję w modelach udaru poprzez parakrynne uwalnianie czynników neurotroficznych, w tym BDNF, VEGF i NT-3.

Czy nowy system NGC może zastąpić autologiczne przeszczepy nerwów?

Opracowany wielofunkcyjny przewodnik nerwowy, oparty na elektroprzędzionych rusztowaniach PCL/kollagen zintegrowanych z hydrożelem na bazie kolagenu zawierającym VINCNPs i MenSCs, wykazał bardzo dobre właściwości fizykochemiczne i biokompatybilność in vitro. W badaniu przedklinicznym na szczurach implantacja HYDVINMEN skutkowała znaczną poprawą regeneracji funkcji czuciowych i ruchowych, zapobieganiem zanikowi mięśniowemu, regeneracją aksonalną i remielinizacją oraz modulacją markerów zapalnych i neurotroficznych.

Wszystkie te obserwowane efekty można przypisać połączonemu działaniu winpocetyny i MenSCs. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych odpowiedzi wymagają lepszej charakteryzacji. Jako potencjalna alternatywa dla autograftingu, platforma będzie wymagała dalszych wysiłków w celu rozwiązania bardziej translacyjnych kwestii, takich jak potwierdzenie wyników w większych modelach zwierzęcych, bardziej istotnych klinicznie, opracowanie standaryzowanych procesów produkcji i sterylizacji dla przewodnika i hydrożelu oraz określenie parametrów uwalniania związanych z komórkami i lekiem w przedklinicznych terminach regulacyjnych.

Te procesy będą wymagane, aby dalej zbliżyć zintegrowany system biomaterialno-komórkowo-lekowy do kliniki i przyszłej translacji klinicznej. Wyniki tego badania otwierają obiecującą drogę do opracowania mniej inwazyjnych i skuteczniejszych metod leczenia urazów nerwów obwodowych, szczególnie w przypadkach dużych ubytków nerwowych, gdzie standardowe autologiczne przeszczepy są obciążone istotnymi ograniczeniami.