Przełom w leczeniu AMD: komórki macierzyste i winpoketyna

Czy nowe strategie leczenia AMD przynoszą nadzieję?

Badacze zidentyfikowali nową, obiecującą strategię leczenia zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), łącząc mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) z winpoketyną. Opublikowane niedawno badania in vitro wykazują, że ta kombinacja może skutecznie przeciwdziałać kluczowym mechanizmom patologicznym związanym z rozwojem AMD.

AMD stanowi główną przyczynę upośledzenia wzroku u osób powyżej 65. roku życia w krajach rozwiniętych. Choroba charakteryzuje się postępującą degeneracją nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i fotoreceptorów. Nabłonek barwnikowy siatkówki pełni kluczowe funkcje w utrzymaniu homeostazy siatkówki, w tym absorpcji światła, fagocytozie, utrzymaniu cyklu wzrokowego oraz równowagi angiogennej. W przebiegu AMD dochodzi do zaburzenia tych funkcji przez złogi zewnątrzkomórkowe (drusen), zlokalizowane między błoną Brucha a RPE. Wielkość i liczba drusen, wraz z obecnością neowaskularyzacji naczyniówkowej (CNV), korelują z ciężkością choroby.

Jakie mechanizmy kryją się za patofizjologią AMD?

Patofizjologia AMD obejmuje czynniki genetyczne i środowiskowe wraz z procesami metabolicznymi związanymi z wiekiem, jednak jest tylko częściowo zrozumiana. Czynniki te przyczyniają się do przewlekłego stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego, spadku autofagii, dysfunkcji bariery krew-siatkówka, angiogenezy i dysregulacji cyklu wzrokowego. Warto zauważyć, że związana z wiekiem nadekspresja genów cyklu wzrokowego może powodować toksyczną akumulację bisretinoidów, przyczyniając się do rozwoju postaci zanikowej AMD.

Szczególnie interesującym aspektem patofizjologii AMD jest obecność agregatów amyloidu-β (Aβ) w drusach, co sugeruje powiązanie z procesami neurodegeneracyjnymi obserwowanymi w chorobie Alzheimera. Badacze wykazali, że Aβ promuje ekspresję czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF-A) i indukuje apoptozę komórek RPE, ułatwiając neowaskularyzację naczyniówkową (CNV) i zaburzając barierę krew-siatkówka. Nadekspresja VEGF jest kluczowa dla neowaskularnej postaci AMD, podczas gdy zmniejszone poziomy czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego (PEDF), inhibitora proteazy serynowej, nasilają angiogenezę. Równowaga między PEDF a VEGF jest krytyczna, a jej zaburzenie prowadzi do rozwoju CNV.

Obecne terapie anty-VEGF podawane do ciała szklistego, choć skuteczne, mają kilka ograniczeń i działań niepożądanych, co podkreśla potrzebę alternatywnych strategii terapeutycznych. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) wykazały potencjał do modulowania środowiska siatkówki i neowaskularyzacji, a kilka badań klinicznych ocenia ich bezpieczeństwo i skuteczność.

Jak przełożyć teorię na praktykę w badaniach in vitro?

Naukowcy wykorzystali model komórkowy AMD, eksponując linię komórkową ARPE-19 na Aβ 1-42, a następnie badali efekty terapeutyczne BMSC, winpoketyny oraz ich kombinacji. Winpoketyna, naturalny inhibitor NF-κB pochodzący z barwinka, wykazuje działanie przeciwzapalne i neuroprotekcyjne, potencjalnie uzupełniając terapię komórkami macierzystymi poprzez modulację szlaków patogennych w RPE.

Badacze zastosowali ludzką linię komórkową RPE (ARPE-19) i poddali ją działaniu Aβ 1-42 w stężeniu 10 μM przez 24 godziny, co jest metodą wcześniej zwalidowaną do modelowania AMD in vitro. BMSC zostały wyizolowane z próbek szpiku kostnego pobranych od dawców po uzyskaniu pisemnej zgody. Charakterystykę BMSC przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej, oceniając ekspresję markerów powierzchniowych CD90-CD105-CD29-CD73 i brak CD45-CD34. Zdolność BMSC do różnicowania się w osteocyty, adipocyty i chondrocyty została zweryfikowana po indukowanym różnicowaniu przez 25-30 dni.

Wyniki badań są niezwykle obiecujące. Ekspozycja na Aβ 1-42 znacząco zmniejszyła przeżywalność komórek ARPE-19 w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak leczenie za pomocą BMSC, winpoketyny oraz ich kombinacji skutecznie przywróciło żywotność komórek, zbliżając liczbę żywych komórek do poziomów obserwowanych w grupie kontrolnej. Ocena morfologiczna komórek ARPE-19 potwierdziła cytotoksyczne działanie Aβ 1-42, o czym świadczy zmieniony kształt komórek i zmniejszona adhezja. Leczenie winpoketyną, BMSC i ich kombinacją znacznie poprawiło morfologię komórkową, przy czym populacje komórek wykazywały zwiększoną integralność strukturalną i silną adhezję do powierzchni hodowli.

Czy badania genetyczne odsłaniają nowe szlaki terapeutyczne?

Co więcej, badacze zaobserwowali, że Aβ 1-42 zaburza równowagę angiogenną poprzez znaczącą nadekspresję VEGF-A, kluczowego mediatora neowaskularyzacji w AMD. Leczenie winpoketyną, BMSC oraz ich kombinacją wyraźnie zmniejszyło poziom mRNA VEGF-A, odwracając wzrost wywołany przez Aβ 1-42. Jednocześnie terapie te spowodowały dalsze znaczące zwiększenie ekspresji PEDF (czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego), wskazując na odpowiedź antyangiogenną.

Szczególnie nowatorskim odkryciem było wykazanie, że Aβ 1-42 zmienia ekspresję genów cyklu wzrokowego. Lecytyna retinol acylotransferaza (LRAT), dehydrogenaza retinolu 5 i 10 (RDH5 i RDH10) oraz białko wiążące retinaldehyd 1 (RLPB1) ulegały znaczącej nadekspresji po ekspozycji ARPE-19 na Aβ 1-42, podczas gdy ekspresja izomerazy retinoidowej (RPE65) była obniżona. Późniejsza ekspozycja ARPE-19 na winpoketynę, BMSC i ich kombinację znacząco odwróciła te efekty.

Badacze sugerują, że Aβ 1-42 zmienia poziom transkrypcyjny kluczowych genów cyklu wzrokowego, promując akumulację produktów ubocznych retinoidów, znanych z upośledzania interakcji między fotoreceptorami a RPE. Obserwacje te potwierdzają związane z wiekiem podwyższenie regulacji głównych genów cyklu wzrokowego. Akumulacja produktów ubocznych cyklu wzrokowego, szczególnie A2E, zwiększa podatność RPE na fotouszkodzenia indukowane światłem niebieskim, zapewniając mechanistyczne połączenie z rozwojem AMD. Wcześniejsze badania wskazują, że zarówno światło, jak i stres mechaniczny obniżają ekspresję genów cyklu wzrokowego poprzez sygnalizację pochodzącą z siatkówki, sugerując ochronną odpowiedź RPE.

W odniesieniu do neowaskularyzacji siatkówki, pojawiające się dowody wskazują, że składniki drusen mogą promować angiogenezę i progresję od suchej do neowaskularnej postaci AMD. Akumulacja drusen, często występująca na lata przed klinicznym objawem choroby, zaburza delikatną równowagę między czynnikami pro- i antyangiogennymi w zewnętrznej siatkówce. Wśród składników drusen, Aβ 1-42, wysoce toksyczny izomer, został powiązany zarówno z chorobą Alzheimera, jak i zwyrodnieniem siatkówki. Aβ 1-42 jest produkowany przez komórki zwojowe siatkówki i RPE, i wykazano, że indukuje stan zapalny, dysfunkcję mitochondriów i angiogenezę w komórkach RPE.

Badanie wykazuje, że ekspozycja na Aβ 1-42 zwiększa ekspresję VEGF-A, jednocześnie tylko nieznacznie podwyższając poziom PEDF, tworząc w ten sposób środowisko proangiogenne. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi indukowaną przez Aβ ekspresję VEGF w komórkach RPE i jego zależne od dawki efekty na angiogenezę. Konkretnie, badacze wykazali, że ekspresja VEGF-A w komórkach ARPE-19 była zwiększona po ekspozycji na Aβ, a wyższe stężenia Aβ prowadziły do podwyższonych poziomów ekspresji VEGF.

VEGF-A jest głównym sygnałem angiogennym w AMD i promuje proliferację komórek RPE oraz tworzenie neowaskularyzacji naczyniówkowej, podczas gdy PEDF, inhibitor proteazy serynowej początkowo rozpoznany w komórkach RPE, wykazuje obecnie działanie antyangiogenne, neuroprotekcyjne i antyapoptotyczne. Wzajemne oddziaływanie między VEGF a PEDF jest kluczowe dla utrzymania homeostazy naczyniowej siatkówki. U pacjentów z AMD obserwowano obniżone poziomy PEDF, szczególnie w interfejsie naczyniówka-RPE, co ułatwia rozwój neowaskularyzacji naczyniówkowej (CNV). Dane z badania sugerują, że zwiększenie ekspresji PEDF, szczególnie za pomocą BMSC i winpoketyny, może być obiecującą interwencją.

Czy połączenie BMSC i winpoketyny to przełom w terapii AMD?

Obecne terapie anty-VEGF stosowane w wysiękowej postaci AMD, choć skuteczne, wymagają wielokrotnego podawania i stwarzają ryzyko powikłań, takich jak zapalenie wnętrza gałki ocznej oraz powikłania ogólnoustrojowe. Dlatego bezpieczniejsze i dłużej działające metody leczenia są pilnie potrzebne. BMSC wykazały potencjał regeneracyjny i antyangiogenny w modelach chorób siatkówki i wczesnych badaniach klinicznych, a winpoketyna, wykazująca właściwości neuroprotekcyjne i przeciwzapalne, hamuje aktywację NF-κB indukowaną przez Aβ i zmniejsza ekspresję VEGF w ARPE-19. W retrospektywnej analizie badającej efekt infuzji winpoketyny u 280 pacjentów z zaburzeniami ocznymi, badacze doszli do wniosku, że najlepsze wyniki osiągnięto w przypadkach zwyrodnienia plamki żółtej, co potwierdza jej możliwą rolę w leczeniu AMD.

Badanie to dostarcza pierwszych dowodów na antyangiogenne działanie winpoketyny w komórkach RPE i wspiera łączne stosowanie winpoketyny i BMSC jako nowego podejścia w leczeniu szlaków patologicznych związanych z AMD. Wcześniejsze badania wykazały, że winpoketyna zmniejsza hiperplazję neointimy i patologiczną przebudowę naczyń, częściowo poprzez hamowanie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i aktywacji ERK1/2 w komórkach mięśni gładkich.

Jakie ograniczenia mają dotychczasowe badania in vitro?

W odniesieniu do patologii związanej z Aβ, badanie wykazało, że Aβ 1-42 indukuje “zaskakującą” nadekspresję genów cyklu wzrokowego; jednak ekspresja RPE65 była obniżona. Ta selektywna supresja może reprezentować wewnętrzny mechanizm ochronny mający na celu zmniejszenie cyklizacji retinoidów indukowanej przez stresory i ograniczenie akumulacji toksycznych produktów ubocznych. Co ciekawe, rosnąca liczba dowodów potwierdza potencjał terapeutyczny strategii farmakologicznych spowalniających cykl wzrokowy, aby zapobiec gromadzeniu się produktów ubocznych retinoidów, które są kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju suchej postaci AMD i atrofii geograficznej. Modulatory cyklu wzrokowego (VCMs), takie jak fenretinid, syntetyczny retinoid, który zmniejsza ogólnoustrojowy poziom retinolu, są obecnie badane w tym celu.

Warto zauważyć, że badanie to, chociaż obiecujące, jest ograniczone przez brak składników śródbłonka naczyniówkowego, które również odgrywają znaczącą rolę w CNV, oraz brak fotoreceptorów, które modulują cykl wzrokowy. Dlatego możliwość zastosowania wyników w praktyce klinicznej pozostaje do pełnego ustalenia poprzez walidację in vivo. Ponadto, chociaż stężenie DMSO stosowanego jako nośnik mieści się w zakresie powszechnie stosowanym in vitro, może ono nadal wywierać efekty pozacelu, które mogą potencjalnie zakłócać interpretację wyników. Dodatkowo, zastosowanie trzech powtórzeń biologicznych na warunek, choć standardowe w wielu badaniach, jest uważane za minimalny próg dla analizy ekspresji różnicowej i może ograniczać czułość wykrywania, szczególnie w przypadku genów o umiarkowanych zmianach ekspresji. Przyszłe badania in vivo są uzasadnione w celu walidacji tych wyników i zbadania potencjalnych synergistycznych interakcji między BMSC a winpoketyną w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku.

Podsumowując, badanie wykazuje, że Aβ 1-42 przyczynia się do cytotoksyczności, angiogenezy i dysregulacji ekspresji genów cyklu wzrokowego w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki – procesów ściśle związanych z patofizjologią AMD. Leczenie za pomocą BMSC, winpoketyny i ich kombinacji skutecznie łagodziło te niekorzystne efekty in vitro, otwierając nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu AMD.

Podsumowanie

Badacze opracowali innowacyjną strategię leczenia zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, łącząc mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego z winpoketyną. Badania in vitro wykazały, że ta kombinacja skutecznie przeciwdziała kluczowym mechanizmom patologicznym AMD, przywracając żywotność komórek nabłonka barwnikowego siatkówki uszkodzonych przez amyloid-β. Terapia ta odwraca niekorzystne zmiany w równowadze angiogennej poprzez zmniejszenie ekspresji VEGF-A i zwiększenie poziomu PEDF, a także normalizuje ekspresję genów cyklu wzrokowego, których zaburzenie prowadzi do akumulacji toksycznych produktów ubocznych retinoidów. Wyniki są szczególnie obiecujące w kontekście ograniczeń obecnych terapii anty-VEGF, które wymagają wielokrotnego podawania i niosą ryzyko powikłań. Badanie dostarcza pierwszych dowodów na antyangiogenne działanie winpoketyny w komórkach RPE i potwierdza potencjał synergistycznego działania obu metod terapeutycznych. Choć wyniki są bardzo zachęcające, autorzy podkreślają konieczność przeprowadzenia badań in vivo w celu pełnej walidacji terapeutycznego potencjału tej kombinacji przed jej zastosowaniem w praktyce klinicznej.